柚皮以维生素C为对照

2.3 柚皮苷、柚皮NaringinDC、苷氢NHDC及槲皮素对铁离子的抗氧还原作用

研究了柚皮苷、NariNgiNDC、化活NHDC及槲皮素4种样品对铁离子的性研还原作用，以VC为对照，柚皮以其浓度-吸光值绘制标准曲线y=0.0006x+0.0943（R²=0.9998），苷氢4种样品对铁离子的抗氧还原作用以VC的相等还原能力时的用量表示，结果如表5所示。化活

由表5可看出，性研4种样品对三价铁离子均有还原作用。柚皮以维生素C为对照，苷氢柚皮苷的抗氧VC抗氧化物质的量为66.48μMoL/g，NariNgiNDC为72.67μMoL/g，化活NHDC为339.63μMoL/g，性研槲皮素为32751.11μMoL/g。4种样品对铁离子还原能力依次为槲皮素＞NHDC＞NariNgiNDC＞柚皮苷。

2.4 柚皮苷、NaringinDC、NHDC及槲皮素对氧自由基的清除效果

以TroLox为对照，以其浓度-吸光值绘制标准曲线y=0.0398x+92.858（R2=0.99），研究柚皮苷、NariNgiNDC、NHDC及槲皮素4种样品对氧自由基的清除效果，结果见图6。按照1.2.4节方法统计样品各浓度的AUC值，4种样品对氧自由基清除效果以TroLox的抗氧化物质的量表示，结果见表6。

由表6可知，4种样品清除氧自由基作用排序为槲皮素＞NariNgiNDC＞NHDC＞柚皮苷，柚皮苷的抗氧化性远小于2种二氢查尔酮，说明在柚皮苷加氢过程中结构发生改变，加氢产物的抗氧化性提高。

2.5 NaringinDC与人铜锌超氧化物歧化酶SOD对接结果

为了从分子水平阐明槲皮素与人铜锌超氧化物歧化酶的作用模式，将槲皮素对接至铜锌超氧化物歧化酶的活性口袋。槲皮素与铜锌超氧化物歧化酶的结合模式如图7a所示，由图7可以看出，槲皮素分子位于一个由氨基酸残基A/Leu106、A/Cys-111、A/iLe-113、A/iLe-151、B/Cys-111和B/iLe-113组成的疏水性腔袋，形成稳定的疏水性相互作用。详细分析可得出：槲皮素的苯环可与氨基酸残基B/Arg-115形成阳离子-π相互作用。重要的是，槲皮素的羟基可与氨基酸残基A/GLy108形成长为2.7A的氢键作用。所有这些相互作用使得槲皮素与铜锌超氧化物歧化酶形成稳定的复合物。

为进一步阐明NariNgiNDC与铜锌超氧化物歧化酶的结合模式，将NariNgiNDC对接至铜锌超氧化物歧化酶的活性口袋，结果如图7b所示。NariNgiNDC位于一个由氨基酸残基A/Leu-106、A/Cys-111、A/iLe-113、A/iLe-151、A/iLe-112、B/Leu-106、B/ALa-1、B/iLe-113、B/Cys-111和B/iLe151所组成的疏水性腔袋，并形成强烈的疏水性相互作用。分析可知，NariNgiNDC的末端苯环可与氨基酸残基B/Arg-115形成阳离子-π相互作用。重要的是，NariNgiNDC可分别与氨基酸残基A/Leu-106、A/GLy-108、A/Cys-111形成长为2.3，2.1A和2.6A的三重氢键作用。所有这些相互作用使得NariNgiNDC与铜锌超氧化物歧化酶形成稳定的复合物。

此外，槲皮素和NariNgiNDC与人铜锌超氧化物歧化酶的结合能分别为-28.4512kJ/MoL和-29.288kJ/MoL。此结果表明槲皮素和NariNgiNDC可能为铜锌超氧化物歧化酶的抑制剂，且NariNgiNDC的活性优于槲皮素。

总之，上述分子对接研究对化合物槲皮素和NariNgiNDC与人铜锌超氧化物歧化酶的相互作用给予合理的解释，为从分子水平解释其相互作用提供了新思路。

2.6柚皮苷、NaringinDC、NHDC及熊果苷对酪氨酸酶的抑制作用

柚皮苷、NariNgiNDC、NHDC及熊果苷4种样品对酪氨酸酶的抑制作用如图8所示。根据不同质量浓度的各样品对酪氨酸酶的抑制率，采用对数方程拟合，得到拟合曲线如表7所示。根据拟合方程计算得到iC₅₀值。

根据表7可看出，4种样品对酪氨酸酶均有抑制作用。由柚皮苷对酪氨酸酶抑制作用的拟合曲线计算得到iC₅₀=33.58Mg/ML；由NariNgiNDC拟合曲线计算得到iC₅₀=13.22Mg/ML；由NHDC拟合曲线计算得到iC₅₀=13.79Mg/ML；由熊果苷拟合曲线计算得到iC₅₀=13.09Mg/ML。比较它们的iC₅₀可以看出：4者对酪氨酸酶抑制能力排序为NHDC＞熊果苷≥NariNgiNDC＞柚皮苷。

2.7 NaringinDC与双孢蘑菇酪氨酸酶的分子对接结果

为从分子水平阐明熊果苷与双孢蘑菇酪氨酸酶的作用模式，将熊果苷对接至酪氨酸酶的活性口袋。熊果苷与酪氨酸酶的结合模式如图9a所示。

由图9可看出，熊果苷分子位于一个由氨基酸残基VaL-248、Phe-264、MeT-280、VaL-283和ALa-286所组成的疏水性腔袋，形成稳定的疏水性作用。分析可知，熊果苷苯环上的4位羟基可与氨基酸残基His-263形成长为2.6A的氢键作用。所有这些相互作用使熊果苷与酪氨酸酶形成稳定的复合物。为进一步阐明NariNgiNDC与酪氨酸酶的结合模式，将NariNgiNDC对接至酪氨酸酶的活性口袋，结果如图9b所示。NariNgiNDC分子位于一个由氨基酸残基Phe-264、Pro-277、MeT280、VaL-283、Pro-284和ALa-286所组成的疏水性腔袋，并形成强烈的疏水性作用。分析可知，NariNgiNDC的末端苯环可分别与氨基酸残基Phe-264和His-263形成π-π堆积作用以及CH-π相互作用。重要的是，NariNgiNDC可分别与氨基酸残基His-244和MeT-280形成长为2.6A和2.0A的双重氢键作用。所有这些相互作用使NariNgiNDC与酪氨酸酶形成稳定的复合物。

此外，熊果苷和NariNgiNDC与双孢蘑菇酪氨酸酶的结合能分别为-25.104kJ/MoL和-27.6144kJ/MoL，推测熊果苷和NariNgiNDC均可能为酪氨酸酶的抑制剂，且NariNgiNDC的活性优于熊果苷。

总之，上述分子对接研究对化合物熊果苷和NariNgiNDC与双孢蘑菇酪氨酸酶的相互作用给予合理的解释，为从分子水平解释其相互作用提供新思路。

2.8 小鼠黑色素瘤B16细胞MTT试验结果

由图10可看出，NariNgiNDC、柚皮苷和熊果苷在500μMoL/L及以下浓度，由B16细胞MTT试验测得的细胞存活率均大于90%，说明NariNgiNDC、柚皮苷和熊果苷在500μMoL/L及以下浓度是B16细胞的安全浓度。

2.9 B16黑色素瘤细胞Hoechst荧光染色试验结果

由图11可看出，在浓度500μMoL/L条件，柚皮苷组、NariNgiNDC组和熊果苷组与空白组对比，细胞密度与数量相近，表明细胞没有凋亡，因此500μMoL/L是药物组的安全浓度。

3 结论

利用4种常见的抗氧化和分子对接方法研究了柚皮苷二氢查尔酮的抗氧化活性，通过测定酪氨酸酶活性研究了其美白活性，通过MTT试验测定了其细胞毒性，所得结论：柚皮苷二氢查尔酮具有较好的抗氧化性和美白活性，对小鼠黑色素瘤B16细胞的安全浓度为≤500μMoL/L。

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